广西瑶、侗、苗、壮等民族外周血白细胞中BKV病毒的研究

课题背景：人多瘤病毒（BKV）感染是一种肾移植相关疾病，可潜伏在肾脏-泌尿系统，或者存在于外周血淋巴细胞。当机体免疫功能降低时，BKV可再度激活，还可在肾移植术后患者中引起 BKV相关的移植肾病（BKVN），导致移植肾功能减退甚至移植丧失。根据文献报告，迄今被研究的对象只限于欧洲，缺少其它国家和地区的资料，目前国内仅有司艺玲等对北京地区汉族健康成人100例的BKV研究报告。近年来，BKVN呈增多趋势，发病率从1%-5.5%不等，其中30%-50%的患者最终导致移植肾功能丧失，已成为影响肾移植效果的主要病毒感染性疾病之一。我国是多民族聚集的国家，肾移植病人国内每年近万例，广西地区肾移植每年近四百例，所以有必要了解广西地区少数民族BKV感染状况，以阐明BKV在人体内的传播方式。

2、技术原理及性能指标：

技术原理：研究采用巢式PCR法，扩增BKV的保守区编码序列。首先，抽取外周血，从外周血中分离单个核细胞，提取其DNA，合成BKV的保守序列的引物，进行PCR扩增。该方法检测BKV-DNA的高敏感性和特异性已被评估，其检出阈值可达3～5个拷贝BKV-DNA质粒；从理论上讲，如果受试样本中存在BKV-DNA，该方法是能检出的。我们在试验中严谨实施巢式PCR，避免检测的假阳性或假阴性，保证了结果的可靠性。

性能指标：实际完成技术指情况如下：①检测广西瑶族、侗族、苗族、壮族四个少数民族各500例健康成人外周血白细胞样本中的BKV-DNA，BK病毒（BKV）的感染率瑶族为 63.60％、侗族为59.80％、苗族为62.00％、壮族为58.60％、汉族为59.00％。②在省级以上期刊发表4篇相关研究论文。

3、技术的创造性与先进性：①在国内率先采用巢氏PCR法检测广西瑶、侗、苗、壮少数民族及汉族健康成人外周血白细胞中的BKV-DNA。②在国内率先从广西不同民族、性别、年龄等几个方面分析了BKV在人群中的感染情况，阐明了该地区的流行现状。③与国内外同类研究相比，观察分析的样本量较大(每个民族各500例)。④首次报道BKV在广西瑶、侗、苗、壮少数民族及汉族健康人PBLs中存在较高的感染率，分别为63.60%、59.80%、62.00%、58.60%和59.00%，平均为60.60%。⑤首次在广西地区证实了BKV存在广泛的潜伏感染，对临床相关疾病防治研究具有一定的参考价值。经广西区医学情报研究所查新结论：国内仅检索到对汉族健康人群进行BK病毒检测的报道，未见有对少数民族人群开展相关研究。且委托观察的样本量较大(每个民族500例)，同时还比较不同民族、不同年龄人群的BKV-DNA检出率。鉴定专家一致认为：该项目的研究成果达到国内领先水平。

4、技术的成熟程度，适用范围和安全性：

技术的成熟程度：Polymerase Chain reaction（PCR）技术对于现代分子生物学的发展产生不可估量的影响，它具有敏感性高、特异性强、重复性好、快速简便的优点，迅速成为分子生物学研究中应用最为广泛的方法。本课题采用的巢式PCR是指利用两套PCR引物（巢式引物）对进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在在内引物的存在下进行第二轮扩增。由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的引物很少）增加了检测的敏感性；又有两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性。可以在10的六次方基因组背景下检测到一个拷贝的病毒基因，是效果最好的PCR。

适用范围：一般应用于病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等。

安全性：为临床提供了一种无痛微创诊断BKV的巢式PCR检测方法（只需抽血3ml）。

5、应用情况及存在的问题：在省级以上期刊发表4篇相关研究论文，研究成果具有较强的创新性，学术价值较高，为临床研究提供了较好的理论依据，具有一定的推广应用价值，其社会效益及经济效益显著。具有能进行实时荧光定量PCR扩增及相关实验的检验技师，具有经卫生部临床检验中心验收合格，颁发有临床基因扩增检验实验室技术验收合格证书，以及具有相关病源的基层医院都可引用该项技术。

　　对肿瘤、肾功能障碍、器官移植（特别是肾移植）等免疫功能低下或缺陷病人本研究实用价值高。国内外对多瘤病毒的研究处于起步阶段，多瘤病毒感染是否也能引起其它（例如ＨＩＶ感染者）相关性病变，有待进一步研究。